（1）可逆反应造成。可以通过适当缩短反应时间来防止逆反应的发生。
（2）体系中发生了别的反应。该反应的底物或者产物在该波长下也有光吸收，并且变化方向相反，超过了希望发生的反应，同样可以通过设置新的对照排除。
（3）反应体系中存在颗粒或者气泡。随着时间延长，颗粒沉淀或者气泡破裂，会导致吸光度显著下降，出现负值。主要注意观察，即可发现是否属于这种情况。颗粒通常来源于样品粗提液，可以提供再次离心，确保得到澄清的上清液；当然也可能来自试剂，测定前观察试剂中是否有沉淀，如果有，一方面待充分溶解后再用，另一方面待颗粒沉淀下来后小心吸取上清液。气泡通常来源于反应本身，可以通过降低反应速度（如减少样品质量提取液体积比）来防止气泡产生。